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AFADESI-MSI是一种新型的常压敞开式离子化技术，无需放射性同位素或荧光标记，通过与高分辨质谱仪联机使用，可直观反映目标分子或者未知化合物分子在生物体内的原位代谢信息，能够解决具有空间分布差异或者结构差异相关的生物学问题。该技术借助于高速的空气流，实现了离子的远距离传输，扩展了待测样品的检测空间和灵活性，灵敏度可达pg级别，动态范围达到三个数量级，覆盖1500个化合物，如胆碱类、多胺类、氨基酸类、肉碱类、核苷类、核苷酸类、有机酸类、碳水化合物类、胆固醇类、胆酸类、脂质类等多种类代谢物。
中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室再帕尔·阿不力孜、贺玖明团队在分析化学一区《Analytical Chemistry》期刊发表封面文章，题为“Mapping Metabolic Networks in the Brain by Ambient Mass Spectrometry Imaging and Metabolomics”的研究成果，采用自主研发的AFADESI-MSI技术，建立了一种高灵敏空间代谢组学方法，实现了大鼠脑组织中多种类极性内源性代谢物的高覆盖成像，结合代谢通路分析，全面绘制脑代谢网络图谱，揭示了东莨菪碱致大鼠记忆功能障碍模型的代谢改变及其脑微区分布特征。（文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c00467）
大脑功能与其复杂的微区结构密切相关。研究脑中分子变化有助于理解中枢神经系统疾病的发病机制，推动药物研发。质谱成像(MSI)技术具有高灵敏、方便、省时以及免标记的优势，已成为绘制蛋白质、代谢产物和脂质图谱的强大工具，但高通量成像表征脑中的极性小分子代谢物仍具挑战。本文对课题组研发的空气动力辅助离子化质谱成像（AFADESI-MSI）平台进行了优化，应用空间分辨代谢组学绘制了大鼠脑代谢网络。
SD大鼠腹腔注射2 mg/kg东莨菪碱（给药组、对照组各3只），安乐死后取出大脑，用冷冻切片机制成20 μm厚的矢状切片，相邻的大脑切片进行H&E和Nissl染色。
SD大鼠腹腔注射2 mg/kg东莨菪碱（给药组、对照组各3只），安乐死后取出大脑，用冷冻切片机制成20 μm厚的矢状切片，相邻的大脑切片进行H&E和Nissl染色。
原始数据转换后应用MassImager软件进行可视化。将光学图像精准匹配感兴趣区域的离子强度，获取差异代谢物信息。通过在线数据挖掘工具Metaboanalyst完成了代谢物的高通量注释。Cyctoscape用于可视化大脑中的复杂网络。
两组大脑样本选择相同的微区进行组织学特征性离子图像叠加，采用t检验(n = 3)进一步验证数据处理结果。
研究通过优化实验确定ACN / H2O（8:2）作为理想的喷雾溶剂。图像中小脑小叶间隔（约为78.0 μm）清晰可见，表明AFADESI-MSI的实际空间分辨率小于100 μm。此外，成像结果显示质量差为30ppm的两种代谢物可以得到明显分离，检测的动态范围高达1000倍。如图所示，通过AFADESI-MSI获得的一些具有代表性的代谢物，离子强度从0~106，其分布特征与脑功能结构高度一致。
图1. AFADESI-MSI和代谢组学绘制大鼠大脑代谢网络的策略，以及代表性极性内源性代谢物离子图像。
实验通过AFADESI-MSI在正负离子模式下获得了298和372个特征离子图像。包括氨基酸、核苷酸、碳水化合物、脂肪酸和神经递质（NTs）等。结果显示γ-氨基丁酸（GABA）在中脑、嗅球和下丘脑中信号强度较高；多巴胺（DA）主要集中分布在纹状体；组胺（HA）作为一种兴奋性NTs集中在丘脑和下丘脑中。松果体在睡眠和光周期调节方面起着重要的作用，由于其体积小容易被忽视。实验在该区域检测到共106种极性代谢物，发现吲哚乙醛、吲哚、5'-甲基硫代腺苷和褪黑素高表达，且褪黑素上游代谢产物血清素(5-HT)在松果体中也有特定的分布。
图2.AFADESI-MSI和MetaboAnalyst获得的大鼠脑中的代谢网络。
研究将光学图像和MSI图像进行精确叠加，从大脑微区中提取代谢图谱进行代谢网络重构。图中显示了包括谷氨酸代谢、花生四烯酸代谢、葡萄糖代谢、嘌呤代谢、三羧酸循环等在内的代谢途径。这些信息有助于在系统水平上深入了解大脑的代谢活动。如图3A所示，嘌呤代谢中，AMP和GMP在大脑皮层和松果体中高表达，但在胼胝体和穹隆中强度较弱。这些结果表明，代谢物的分布在大脑中表现出功能区域特异性。
图3.AFADESI-MSI获得大鼠脑内嘌呤代谢途径及相关代谢产物分布(A)和AMP在大鼠脑各层的分布(B)。
如图展示了NTs及其相关代谢物在大鼠脑内的分布特征和联系。结果表明代谢物在脑微区结构中的代谢速度是可变的，并定义了区域内稳态的条件。如组氨酸作为组胺（HA）的前体在松果体中分布稍高，而HA仅在丘脑和下丘脑中观察到；HA代谢下游产物甲基组胺在丘脑和下丘脑中的分布比HA更广泛，从而进一步证明了代谢网络的区域多样性和复杂性。
图4.(A)神经递质及其相关代谢物在大鼠脑中的分布;(B)神经递质调节和代谢网络。
研究应用AFADESI-MSI分析了对照组和东莨菪碱治疗的大鼠脑矢状切片。显示了差异代谢物在不同脑微区的含量，如N-甲酰犬尿氨酸、L-色氨酸和5-HTP这三种代谢物同属于色氨酸代谢通路，表明东莨菪碱扰乱了脑区色氨酸代谢过程或相关代谢物的区域间转运。此外，NTs调节网络也受到了干扰，脑导管内HA和甲基组胺升高， GABA、Glu、谷胱甘肽也发生变化。对给药组大脑的10个微区进行了分析，结果在脑桥中发现16个异常代谢物，而在大脑皮质中发现7个异常代谢物，表明脑桥和大脑皮质可能是对东莨菪碱作用最敏感的区域。
图5.东莨菪碱模型大脑中代谢网络改变。
如下图所示，显示了其中几种异常表达的代谢产物的分布，如腺嘌呤在小脑皮层发生显著下调;HA在脑导水管下调 (图6A-H)。这些代谢物的相对定量信息进一步表明，药物效应在大脑中具有多样性和区域特异性。基于空间分辨的代谢组学为发现酶或基因异常提供了线索，但要完成完整的代谢网络分析需要在蛋白质和基因水平上进一步验证。
图6.东莨菪碱治疗大鼠学习记忆障碍脑模型的AFADESI-MSI图像和代谢物统计结果(n = 3)。
本研究开发了一种针对极性内源性代谢小分子高灵敏、高覆盖的分子成像方法，通过AFADESI-MSI空间代谢组学分析，全面绘制了脑代谢网络及其空间分布，无需衍生化和复杂的前处理，实现了对NTs、核苷酸代谢物、多胺、肌酸等极性分子的可视化，为脑中生理、病理和药理过程的机制、功能、以及神经系统中各区域间的相互联系提供了线索和代谢网络调控研究的新视角。本文运用该方法进一步研究了东莨菪碱模型脑的微区代谢变化，结合统计分析，揭示了与记忆功能障碍直接相关的代谢通路显著改变及其微区分布特征。
数据来源：“质谱成像”微信公众号
中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室再帕尔·阿不力孜、贺玖明团队在《PNAS》上发表了一篇题为“Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations”的研究论文，采用AFADESI-MSI技术，建立了空间分辨的原位代谢组学方法，并提出一种“下游代谢物与上游代谢酶关联” 的研究策略来表征肿瘤代谢改变；结合免疫组化分析验证，从代谢物和代谢酶两个层次和组织原位深入探究食管癌的代谢改变，发现并可视化表征了食管癌异常的代谢通路及其代谢酶。（文章链接：https://doi.org/10.1073/pnas.1808950116）
独特的代谢模式是肿瘤细胞区别于正常细胞的重要特征，越来越多的研究表明，在肿瘤的发生、发展过程中，肿瘤细胞会发生特定谱式的代谢改变以适应肿瘤生长。对于不同组织来源的肿瘤细胞，尽管彼此间的基因变异谱千差万别，但是，几乎所有的肿瘤都需要通过类似的代谢重编程（Metabolic Reprogramming）来维持其无限制的细胞增殖。肿瘤代谢的表征能够为癌症病理机制研究、肿瘤诊疗新指标和干预靶点的发现提供新的契机。然而，到目前为止，如何全面的发现肿瘤的异常代谢，尤其是如何从代谢物和代谢酶两个层面上原位地表征肿瘤的异常代谢仍然面临非常大的困难。
收集256例人鳞片状食管癌（ESCC）组织标本，包括癌组织、癌旁组织和远端非癌组织，制成冰冻组织切片。如图1所示，采用空气动力辅助解吸电喷雾离子化质谱成像技术（AFADESI-MSI），采集上述组织中内源性代谢物及其空间分布信息；对相邻切片进行HE染色；采用MassImager质谱成像数据处理软件，使质谱成像图与HE染色图匹配重合，按不同组织类型及空间分布提取代谢物轮廓信息；使用SIMCA软件进行多变量统计分析，筛选出与肿瘤代谢相关的差异代谢物；根据差异代谢物及其鉴定结果富集分析发生变化的代谢通路及推测关键代谢酶；采用免疫组化方法检测锁定的代谢酶表达，进一步验证其与代谢标志物是否具有同样的空间分布特征。
脯氨酸作为细胞微环境中的重要氨基酸参与细胞凋亡和自噬，在癌症代谢中的重要作用得到越来越多的关注。根据256个食管癌组织样本的统计数据，癌区脯氨酸离子强度显著高于上皮和肌肉区(P<0.001，图2C)。采用免疫组化方法检测与脯氨酸合成相关的关键代谢酶吡咯-5-羧酸还原酶2（PYCR2）在ESCC组织切片中的空间表达，发现PYCR2只在癌区表达(图2e)，与食管癌组织中脯氨酸的空间分布一致。
图2 脯氨酸生物合成途径中关键代谢物和代谢酶的原位分析（A）脯氨酸的质谱成像（B）光学-MSI重叠图像（C）256例鳞片状食管癌（ESCC）患者癌组织和相邻上皮、肌肉组织中脯氨酸水平 ***p<0.001（D）ESCC组织的HE染色图 （E）不同ESCC组织中PYCR2的表达 CT，癌组织；ET，上皮组织；MT，肌肉组织
尿苷是RNA合成的重要核苷前体，也参与嘌呤核苷酸生物合成和碳水化合物代谢。此外，组织中尿苷的水平对于嘧啶类抗代谢药物的抗肿瘤治疗至关重要。研究发现癌组织中尿苷含量高于上皮组织而低于肌肉组织（P<0.001,图3 A1和A3），而尿嘧啶的含量在癌组织中显著升高（P<0.001,图3 A2和A4），尿嘧啶/尿苷离子强度比（图3A6）在癌区显著增加，可以作为区分癌组织与癌旁正常组织的生物标志物。同样，免疫组化结果显示催化尿嘧啶生成尿苷的代谢酶尿苷磷酸化酶1(UPase 1)在癌组织中的表达上调。
图3A 尿苷代谢途径中关键代谢物和代谢酶的原位分析（A1，A2）尿苷和尿嘧啶的质谱成像图 （A3，A4）256例鳞片状食管癌（ESCC）患者癌组织和相邻上皮、肌肉组织中尿苷和尿嘧啶水平 ***p<0.001（A5）UPase 1介导的尿苷转换为尿嘧啶的代谢过程（A6）根据尿嘧啶/尿苷离子强度比值构建的质谱成像图 （A7）癌组织和相邻上皮、肌肉组织中尿苷和尿嘧啶的强度变化（A8）ESCC不同区域UPase 1的表达 CT，癌组织；ET，上皮组织；MT，肌肉组织
组氨酸在组氨酸脱羧酶(HDC)的介导下代谢为组胺。有越来越多的证据显示组胺直接参与致癌作用，可以作为一种潜在的细胞保护剂来改善癌症治疗。根据一些研究者的说法，基于组胺的治疗能促进癌细胞中DNA损伤、凋亡和衰老并可以显著增加患癌动物的存活率。在本研究中，组氨酸和组胺呈现完全相反的空间分布。根据256例食管癌组织样本的成像数据，组氨酸在癌组织中显著上调而组胺显著下调。组胺与组氨酸的离子强度差异如图3B7所示。通过计算组胺与组氨酸的离子强度比，对HDC介导的组氨酸脱羧反应进行了研究(3B6)，发现肿瘤组织的脱羧率相对于肌肉和上皮组织较弱。和基于强度比的质谱成像预测的一致，肿瘤组织的HDC表达水平低于肌肉组织和上皮组织。
图3B 组胺代谢途径中关键代谢物和代谢酶的原位分析 （B1，B2）组氨酸和组胺质谱成像图（B3，B4）256例鳞片状食管癌（ESCC）患者癌组织和相邻上皮、肌肉组织中组氨酸和组胺水平 （B5）HDC介导的组氨酸转换为组胺的代谢过程（B6）根据组胺/组氨酸离子强度比值构建的质谱成像图（B7）癌组织和相邻上皮、肌肉组织中组氨酸和组胺的离子强度变化（B8）ESCC不同区域HDC的表达。此外，发生改变的代谢途径还有谷氨酸代谢，脂肪酸合成以及多胺的生物合成，均在肿瘤组织中表现为显著增多，相应的免疫组化结果也证明与上述途径有关的关键代谢酶在癌区的表达也明显上调。以下（表1）为通过256例食管癌患者组织样本筛选出的发生改变的6条代谢途径和相应的关键代谢酶：
表1 筛选出癌症相关的代谢产物、代谢酶、代谢途径
该研究建立了一种高灵敏的空间分辨的原位代谢组学方法，对食管癌潜在原位标志物进行了代谢通路分析，并对通路上相关联代谢物的分布特征进行原位可视化表征，分析其空间变化趋势，发现了并验证了6个在食管癌中异常表达的代谢酶：吡咯-5-羧酸还原酶2(PYCR2)、谷氨酰胺酶(GLS)、尿苷磷酸化酶1(UPase1)、组氨酸脱羧酶(HDC)、脂肪酸合成酶(FASN)和鸟氨酸脱羧酶(ODC)，它们广泛参与食管癌相关的肿瘤代谢过程，其中PYCR2和UPase1被首次发现在食管癌中异常改变。研究结果表明脯氨酸生物合成，谷氨酸代谢，尿苷代谢，组氨酸代谢，脂肪酸合成，多胺生物合成等代谢通路在食管癌组织中发生了显著变化。这些癌症代谢相关信息有助于增加对癌症代谢重编程的理解。基于AFADESI-MSI技术的空间分辨原位代谢组学方法，不仅可验证肿瘤原位标志物的可靠性；同时针对肿瘤等具有复杂结构的组织，它具有原位、无需特殊标记、无需复杂耗时的前处理及反复染色过程，能够高通量地发现肿瘤异常变化的代谢通路及其代谢酶等优势；可从代谢物和代谢酶两个层次全面表征肿瘤的代谢改变并发现其潜在功能，为深入探究肿瘤的代谢改变提供了全新的研究视角。
数据来源：“质谱成像”微信公众号
中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室再帕尔·阿不力孜、贺玖明团队在《Theranostics》上发表了一篇题为“Evaluation of the tumor-targeting efficiency and intratumor heterogeneity of anticancer drugs using quantitative mass spectrometry imaging”的研究论文，采用空气动力辅助解吸电喷雾离子化（AFADESI）技术和基于人工神经网络（ANN）的虚拟校正-定量质谱成像（VC-QMSI）方法，建立了针对紫杉醇及其衍生物前药的体内定量成像方法，为评估该类药物的肿瘤靶向效率和瘤内异质性分布提供了直观有效的途径，也为靶向抗肿瘤新药研发提供了有力的研究工具。（文章链接：doi: 10.7150/thno.41763. eCollection 2020.）
可区分正常组织和肿瘤组织的靶向抗肿瘤药物开发是癌症治疗研究中的关键问题。在新药研发的早期，如何快速评估抗癌药物的肿瘤靶向性非常重要，且了解药物在肿瘤内的异质性分布更具挑战。开发一种高精度、高灵敏度的定量成像分析方法有望解决这一难题。质谱成像是一种无需标记的分子成像技术，它可提供有关生物体内药物和代谢物分布的时空信息，其在药物开发领域的应用正在迅速增加。紫杉醇具有很强的抗肿瘤活性，但直接用药常伴随有骨髓抑制、神经毒性等严重不良反应；近年来临床致力于对紫杉醇进行结构优化、剂型改造或前体药物开发，以提高药物的肿瘤靶向能力，减少副作用。本研究建立了紫杉醇及其衍生物前药的体内定量成像方法，评估了该类药物的肿瘤靶向效率和瘤内异质性分布。
通过构建含已知浓度药物的模拟生物组织，建立了定量质谱成像标准曲线；采用空气动力辅助解吸电喷雾离子化质谱成像（AFADESI-MSI）技术，同时采集药物、药物代谢物和内源性代谢物信息；以内源性代谢物为内标，结合ANN方法，构建了生物组织中质谱响应基体效应自动预测与校正的回归模型，对动物切片的单位像素进行逐一定量，从而建立了整体动物体内药物质谱成像分析方法。将该方法用于评估静脉注射紫杉醇（PTX）、紫杉醇脂质体（PTX-liposome）和紫杉醇前药（PTX-R）在A549细胞异种移植裸鼠中的靶向效率和瘤内的分布异质性。
该策略的步骤如下：采用含有相同药量的不同类型的模拟组织，筛选出与药物响应强度变化紧密相关的内源性代谢物，并建立药物的相对响应强度（相对校正因子RCF）与内源性代谢物离子强度之间的ANN模型（图1A）。根据该模型自动预测整体动物切片中每个像素的RCF值(RCFpredicted)，并根据公式Intensitycal = Intensity /RCFpredicted获得校正后的药物响应强度（Intensitycal）。将校正响应值用于构建标准曲线，其线性相关系数从未校正的0.45增至校正后的0.99（图1C）。 使用校正后的标准曲线确定整体动物体内的药物绝对含量。此外，该方法利用丰富的内源性代谢物质谱信息，通过机器学习可自动识别动物体内的生理分区（图1D）；它可替代需在光学或H&E染色指导下的人工分区方法。综上，VC-QMSI可用于复杂的整体动物样本中药物的空间分辨定量分析（图1E）。
图1 VC-QMSI策略在整体动物组织中准确定位抗肿瘤药物的过程示意图 （A）基于内源性代谢物的机器学习方法预测相对校正因子的示意图 （B）不同器官的相对校正因子成像以及相对校正因子预测值和实测值的比较；缩写：H心脏，Li肝脏，Sp脾，Lu肺，K肾，Br大脑，M肌肉，Tu肿瘤 （C）以药物含量-未校正的药物响应强度构成的标准曲线和以药物含量-校正后的药物响应强度构成的虚拟校正标准曲线对比 （D）通过使用K均值和t-SNE聚类分析进行自动像素标记的整体动物分割图像 （E）整体动物体内药物定量的可视化结果以及光学图像
PTX组和PTX-liposome组：PTX在动物体内呈广泛分布，在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、肠、胃和肿瘤组织中均有分布；在健康组织中的含量远高于PTX-R组；给药后期可观察到PTX在胃肠道中大量积累，而在肾组织中几乎不见，提示PTX可能主要通过胆汁-粪便途径排泄。PTX-R组：与前两组的广泛分布不同，PTX-R主要分布于肿瘤组织，其次是肺和肠。三组小鼠脑中均没有明显的药物分布。就24h内的肿瘤组织药物暴露量而言，PTX-R组与PTX-liposome组相当，是PTX组的2倍；以PTX组为参比，PTX-R组的相对靶向效率（RTE）是PTX-liposome组的近50倍。以上证明PTX-R有良好的肿瘤靶向能力。
图2 三个给药组在不同时间点的AFADESI-MSI可视图（A）PTX在整体动物体内的时空和定量分布（B）PTX在肿瘤组织中的时空和定量分布
肿瘤根据形态学的异质性可分为不同的微区（图A，B）。基于代谢物特征采用t-SNE和k-means等手段得到的肿瘤微区自动识别的结果（图C）与H＆E染色结果（图A）高度一致。PTX-R在肿瘤坏死区域和胶原蛋白区域的含量明显高于肿瘤薄壁组织区域（图D，E, F），表明PTX-R具有出色的肿瘤穿透能力。对比肿瘤的薄壁组织和间质区域，PTX-R更多地积累于肿瘤中未明显分化的区域，比如肿瘤的胶原蛋白区域和脂肪组织。这种药物在肿瘤微区分布的异质性值得进一步研究，它对于认识肿瘤的生长、侵袭、对药物的敏感性以及预后均有重要作用。
图3 PTX-R在瘤内的异质分布（A）肿瘤组织的H＆E染色图像（B）放大倍数（×20）的代表性肿瘤微区（C）基于代谢物谱的肿瘤微区的t-SNE空间分布（D）PTX-R在肿瘤微区中的分布（E）药物离子成像和H＆E染色成像之间的耦合匹配叠加图（F）肿瘤微区中PTX-R的定量分布
采用无需标记的AFADESI和VC-QMSI技术成功建立了针对紫杉醇及其前药的定量质谱成像方法，评估了该类抗肿瘤药物的肿瘤靶向效率和瘤内分布异质性，并提供了直观的实验证据表明设计的紫杉醇前药具备优异的肿瘤蓄积能力和低全身毒性。进一步证明AFADESI-MSI技术具有高灵敏和宽覆盖的特点，可在整体动物的体内微区同时可视化各种类型的药物、代谢物和内源性代谢物。VC-QMSI方法将内源性代谢物作为内标，建立ANN模型；根据模型预测每个像素的RCF值，并校正药物离子强度，从而实现药物在整体动物和亚器官组织中的定量可视化。紫杉醇前药及其代谢物的体内定量分布研究有助于从药物的保留、消除、靶向和释放四个角度设计有效的肿瘤靶向药物。所建方法有助于预测与药物分布相关的药效和安全性，在抗肿瘤药物研发早期进行直接快速的药效筛查，减少损耗、降低成本。此外，本研究对阐明药物的功效、毒性和耐药性提供了一个深入的视角，有助于抗肿瘤药物的设计和优化。
数据来源：“质谱成像”微信公众号
